蜂蜜中甘油含量的应用方案（紫外分光光度法）
蜂蜜中甘油含量的应用方案（紫外分光光度法）
方案依据GB/T 18932.6---2002蜂蜜中甘油含量紫外分光光度测定方法。甘油的方法检出限为20 mg/ kg。
关键词 紫外 甘油 蜂蜜
原理
甘油在甘油激酶催化作用下,与腺苷-5，-三磷酸盐反应生成L-甘油-3-磷酸盐和腺苷-5'-二磷酸盐。而生成的腺苷-5’-二磷酸盐在丙酮酸盐激酶的存在下,又与磷酸烯醇丙酮酸盐反应,再转化成腺苷-5'-三磷酸盐和丙酮酸盐。丙酮酸盐在L-乳酸盐脱氢酶的作用下﹐被烟酰胺腺嗫呤二核苷酸还原为L-乳酸盐。通过在340 nm测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸消耗量,计算出甘油含量。
仪器试剂和材料
比色: 1cm光路。微量注射器:100ul
溶液一;2.0 g辅酶和甘氨酸缓冲溶液的混合物, pH=7.4。其中缓冲溶液中含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,7mg;腺苷-5’-三磷酸盐，22 mg;磷酸烯醇丙酮酸盐，1l mg;硫酸镁;稳定剂。贮存在4℃冰箱里。使用前在室温下放置1 h,加人11 mL.水,使之完全溶解,摇匀。
溶液二:0.4 mL的悬浊液。含有丙酮酸盐激酶,240U;L-乳酸盐脱氢酶,220 U。贮存在4℃冰箱里。使用前在室温下故置1 h。
溶液三:甘油激酶悬浊液,34 U。贮存在4℃冰箱里。使用前在室温下放置1h.
甘油标准溶液:394 mg/L。贮存在4℃冰箱里。使用前在室温下放置1h。仅作为测定质量监控用,测定值与给定值允许差为5%。
试样制备与保存
试样的制备
对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室湿。分出0.5 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中,密封,并标明标记。将试样于常温下保存。
分析步骤
称取1g试样,精确到1mg.盘于100 mL三角瓶中,加水使试样完全溶解,定容至20 mL.
紫外分光光度法测定
取三个比色皿,分别用于空白溶液,试样测定液和标准溶液的测定。
a)对盛空白溶液﹑试样测定液和标准洛液的比色皿中分别加入l mL溶液一
b)对盛空白溶液的比色皿中加入2 mL水;对盛试样测定液的比色皿中加入2 mL试样测定液，对盛标准溶液的比色皿中加人0.10 mL标准溶液和1.9 ml水﹔
c)对盛空白溶液、试样测定液和标准溶液的比色皿中分别加人0.010 mL溶液二
d)将比色皿内溶液充分混合,待反应10 min后,用紫外分光光度计在 340 nm的波长处连续测定空白溶液、试样测定液和标准溶液的吸光度各10次,分别计算各自吸光度的平均值A ﹔
e)对盛空白溶液﹑试样测定液和标准溶液的比色皿中分别加人0.010 mL溶液三;
F)操作步骤同D)分别计算各自吸光度的平均值A2;
按上述步骤,对同一试样进行平行试验测定。
结果计算
根据上面的测定,分别求出空白溶液和试样测定液两次测定吸光度的差值(A一Az),用试样测定液吸光度的差值减去空白溶液吸光度的差值,求出∆A,即:
蜂蜜中甘油的含量按式(2计算:
式中:
c———试样中甘油含量,单位为毫克每千克( mg / kg>:
∆A———由式(1）计算求出﹔
440—-—由甘油相关的物理常数计算得出。
仪器参数
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